湖州市博物馆主要陈列主题是湖州历史文化和自然环境，主要包含三部分。

第一部分是湖州古代文化陈列，展示了湖州境内吴文化、越文化和宋元明清时期湖州文化的历史文物和造型艺术。第二部分是湖州民俗文化陈列，包括节庆、民间信仰、民间工艺、民间文艺等方面的展示。第三部分是湖州自然地理陈列，展示了湖州地理环境、生物多样性和湖州地区水利建设的历史变迁，通过这三部分内容的展示，着重展示了湖州地区人民的历史文化、自然生态和物质生活状况。