离心技术:是分离纯化蛋白质、酶、核酸(DNA、RNA)、细胞的最常用方法之一。
电泳(electrophoresis):带电粒子在电场中向着与其所带电荷相反方向电极移动的现象。可用于分离不同分子量的生物大分子。
1. 蛋白质的电泳:用途:蛋白质的定量。
2. 核酸的电泳:用途:用于核酸的分离、鉴定、纯化、回收。比如:我只需要长度300bp左右的分子。那么,电泳后,在切胶过程中,只切300bp处的分子即可。蛋白质研究相关的技术:
1. 含量测定:2. 结构的测定:(1)一级结构的测定:搞清楚蛋白质肽链的氨基酸排列顺序。方法:Edman降解法、质谱法(MS, 将蛋白水解,多肽链分成小段。检测肽段)(2)空间结构测定:蛋白空间结构分析比一级结构分析复杂得多。方法:X射线衍射晶体分析法、核磁共振法等。
3. 功能的测定:(1)酵母双杂交(YTH):假设:欲检测蛋白X与蛋白Y是否相互作用。检测方法:将蛋白X与报告基因转录因子的BD融合;将蛋白Y与AD融合;确认蛋白X与蛋白Y形成的复合体能否激活报告基因的表达。如果能激活报告基因的表达,说明:X与Y形成了复合体,则BD和AD靠近,激活了下游报告基因的表达;反之,报告基因不表达。原理:真核生物的转录因子(尤其是酵母转录因子GAL4),包括两个彼此分离、但功能必需的结构域:一个是与DNA结合的结构域-BD;一个是转录激活域-AD。BD识别转录因子效应基因的上游序列并与之结合;AD通过与转录复合体的其他成分作用,启动下游的基因转录。即使BD与AD分开,但如果在空间上较为接近时也能激活转录。——利用转录因子的BD、AD这一特性,通过检测转录因子是否启动了其效应基因的表达,可研究蛋白质X与Y是否相互作用。
(2) 蛋白质芯片技术:一种高通量、微型化、自动化的蛋白质分析技术。一次试验中可同时检测几百甚至几千种目标蛋白或多肽。
(3)免疫印迹技术 Western blotting:利用抗原抗体特异反应的原理。用途:检测样品中特定蛋白质是否存在以及半定量分析、研究蛋白质间的相互作用。